Cell：西湖大学陶亮团队等揭示超毒力分支艰难梭菌外毒素B的病理相关受体 | Cell Press对话科学家
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2022年3月17日，西湖大学生命科学学院的陶亮团队与合作者在Cell Press细胞出版社期刊Cell上发表了题为“TFPI is a colonic crypt receptor for TcdB from hypervirulent clade 2 C. difficile”的研究论文。文章首次报道了组织因子途径抑制物（TFPI）是超毒力分支艰难梭菌的外毒素B在宿主中与病理发生相关的受体，这对于深入理解艰难梭菌感染的致病机制有着重要的科学意义，并为此类感染疾病的预防和治疗提供了重要的理论依据。
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艰难梭菌感染是全球范围内造成医院和社区获得性肠道腹泻和伪膜性结肠炎的最主要原因之一，严重时直接危及生命。临床分离的艰难梭菌有5个主要的分支，其中的II型分支又称超毒力分支，是近年来北美和欧洲数次艰难梭菌爆发感染的罪魁祸首。艰难梭菌感染致病决定性地依赖于其表达的外毒素，尤其是外毒素B（TcdB）。超毒力分支的艰难梭菌独有地表达两种TcdB亚型（TcdB2和TcdB4），它们如何识别宿主细胞并诱导疾病发生一直是个未解之谜。
陶亮博士等此前发现FZD是艰难梭菌I型分支TcdB1的肠道上皮细胞受体，但FZD并不能被超毒力分支艰难梭菌的TcdB2和TcdB4所识别。在这项研究中，陶亮团队首先发现包括HeLa在内的一部分细胞对TcdB4高度敏感，预示这些细胞里含有一类TcdB4的未知受体。基于此，作者采用了一种全基因组水平的基于CRISPR/Cas9的基因敲除文库筛选技术，对HeLa细胞文库用TcdB4进行多轮压力筛选后锁定了多个相关的宿主因子包括TFPI。利用分子、细胞、和生化等手段，作者验证了TFPI可在细胞表面结合TcdB4并介导后者进入胞内发挥生物学活性，从而起了细胞受体的功能。TFPI的胞外区里包含有两个被称为Kunitz的保守结构域，实验证明TcdB4可以特异性地结合第二个Kunitz结构域（K2）。之后陶亮团队与同属西湖大学的施一公团队开展合作，利用冷冻电镜三维重构技术解析了分辨率为3.1Å的毒素-受体复合物的三维结构。有趣的是，TcdB4识别TFPI的结合界面与已知的TcdB1识别FZD的结合界面高度重合，反映了该受体结合域在进化上的保守性。对受体结合区的序列作系统进化分析后发现，TcdB亚家族可分为两大类群：一类包含了TcdB1/3/5等亚型，识别FZD蛋白作为受体；另一类为超毒力分支艰难梭菌中的TcdB2和TcdB4，以TFPI作为受体入侵肠道上皮。最后，作者利用小鼠模型来研究TFPI作为超毒力分支艰难梭菌TcdB受体在体内的生理学意义。通过腹腔注射一定剂量的TcdB4来进行毒素挑战实验后发现，野生型小鼠在注射后的12小时内全部死亡，而超过60%的部分敲除TFPI的小鼠可以耐受毒素并最终存活。病理切片研究显示野生型小鼠的肾脏损伤严重，而敲除小鼠肾脏基本完好。在艰难梭菌感染发生的主要部位肠道，TFPI高表达于被称为隐窝的结构中。利用肠道结环实验，作者还发现含有TFPIK2区域的可溶蛋白作为“诱饵”可以有效阻止TcdB2或TcdB4对肠上皮的破坏，展现了利用TFPI衍生物作为中和蛋白在预防和治疗超毒力艰难梭菌感染中的潜在应用价值。
作者专访
Cell Press细胞出版社特别邀请论文通讯作者陶亮研究员代表团队进行了专访，请他为大家进一步详细解读。
CellPress：
艰难梭菌 （CDI）感染是最常见的医院获得性感染之一，其产生的TcdB在引起胃肠道疾病中起着关键作用。请问目前TcdB有多少变体，这些变体的受体有何差异？
陶亮研究员：
基于我们此前对艰难梭菌TcdB序列的系统性研究，目前已知TcdB有至少8个变体（亚型）。其中TcdB1、TcdB2、TcdB3、TcdB4、TcdB5这5个亚型存在于艰难梭菌主流分支的菌株中，被认为与致病紧密关联。
通过包括本研究在内的一系列工作，我们目前对TcdB变体与受体的选择偏好已经有了一个较全面的认识。TcdB1、TcdB3和TcdB5劫持WNT信号通路的FZD蛋白作为受体来入侵肠道上皮细胞，而TcdB2和TcdB4则利用TFPI作为受体来破坏肠道上皮屏障。此外，部分TcdB还可以利用一种名叫CSPG4的蛋白作为受体，CSPG4在肠道上皮细胞中不表达，仅表达于上皮细胞下的成肌纤维细胞中。目前已知TcdB1和TcdB2可以高效识别CSPG4，而TcdB3和TcdB4几乎不识别CSPG4。由于受体识别的差异性，TcdB各亚型在动物模型中可以诱导产生不同的病理特征，反映在临床上的病症也会有所不同。
CellPress：
请问本研究是如何找到clade 2 C. difficile中TcdB受体的？
陶亮研究员：
本研究采用了一种名为全基因组水平的基于CRISPR/Cas9技术的基因敲除文库筛选，这种技术目前已经广泛用于鉴定与各类病原体作用相关的宿主因子。简单来说，如果某个宿主因子（比如受体）参与了毒素作用于细胞的过程，那么含有该宿主因子的基因缺失突变的细胞就会对毒素产生抗性。如果把毒素加入一群含有各种细胞因子缺失突变的细胞中，只有对毒素产生抗性的细胞才会存活下来，通过测序就可以回溯存活细胞中的突变基因，找到对应的宿主因子。
在实际操作过程中实验的具体设计也是十分关键的，甚至可以说是成功的关键。Clade 2 C. difficile表达有TcdB2和TcdB4两个亚型，由于我们已经知道TcdB2可以紧密结合CSPG4而TcdB4几乎不识别CSPG4，出于避免受体冗余干扰的考虑，我们选择了TcdB4来进行筛选。在细胞的选择方面，我们测试了不同种类的细胞后发现HeLa等部分细胞株对TcdB高度敏感，预判这些细胞中含有一类未知的受体，从而选择HeLa细胞来构建我们的文库。
CellPress：
请问本研究利用冷冻电镜（cryo-EM）确认出TcdB4-TFPI的结构有何特点？
陶亮研究员：
利用冷冻电镜的方法，我们解析了TcdB4和TFPI结合的复合物结构，尤其是获得了高分辨率的毒素-受体结合界面，对于理解互作的发生和进一步设计靶向药物分子有着重要的意义。该复合物结构的另一个重要特点是和之前解析的TcdB1-FZD以及TcsL-SEMA6A复合物结构模式上非常类似。这一发现进一步确定了包括TcdB和TcsL在内的大梭菌毒素包含了一个进化上保守、功能上分歧的受体结合域，对于理解包括TcdB在内的一系列大梭菌毒素的进化、工作机制、和相关病理都有重要的意义。
CellPress：
请问TFPI是如何诱导肠道和肾脏相关病理过程发生的？
陶亮研究员：
TFPI诱导病理发生主要是通过受体作用介导毒素靶向特定的细胞来完成的。在肠道上皮层中，TFPI高表达于一种被称为隐窝（crypt）的肠道结构里，TFPI介导毒素入侵位于隐窝中的肠道上皮细胞，不仅使得肠道上皮屏障的完整性被破坏，更重要的是隐窝是肠道上皮自我维持和修复的关键部位，隐窝的损伤将导致肠道上皮的再生修补功能被抑制，从而放大了毒素的破坏效果。在肾脏中，我们观察到的病理损伤集中在肾小球部分，这里也是毛细血管最为丰富且高表达TFPI的部位。对肾脏的损伤是发生在毒素全身性暴露的情形之下的，我们推断毒素是通过血液循环进入肾脏，而在TFPI高表达的肾小球部位得到富集，并造成严重的细胞损伤。此外，TcdB与TFPI的结合还可以干扰凝血通路途径，尽管具体机制还不清楚，我们认为这可能在病理的发生中也起到了一定的作用。
CellPress：
请问TFPI阻断剂的处理对TcdB引发的肠道损伤有何缓解作用？
陶亮研究员：
从小鼠模型实验的结果来看，TFPI阻断剂对于超毒力艰难梭菌TcdB在肠道中引发的粘膜下水肿、粘膜水肿、免疫细胞浸润、表皮层破损、和肠道隐窝侵蚀都有明显的缓解作用。
CellPress：
本研究证实了TFPI是clade 2 C. difficile中TcdB的相关受体，请问该研究成果能够为揭示CDI的发病机制和治疗提供怎样的帮助？
陶亮研究员：
受体是决定宿主组织器官和细胞对某一病原体是否敏感的决定性因子，很多时候也是病理表征区别的决定性因子，因此揭示病原体的宿主受体历来是理解感染疾病致病机制的核心问题之一。对于C. difficile感染来说，由于其致病依赖于毒素TcdB进行，因此找到TcdB的宿主受体是一个理解C. difficile感染机制的关键。Clade 2 C. difficile感染可以造成严重的肠道病症，然而在不知道其受体的时候，人们就无从得知该病原体主要攻击肠上皮中的哪个具体部位，哪些细胞类群，如何诱发后续的症状。我们的研究揭示了TFPI是Clade 2 C. difficile TcdB的受体，基于TFPI的分布和蛋白特征，就可以解释很多之前的疑惑，比如为何Clade 2 C. difficile感染后隐窝损伤严重，为何CDI造成肠道上皮损伤后的恢复十分困难等。
从开发预防和治疗方法的角度讲，病原体受体研究也是相关理论基础中的重中之重。只有在阐示了病原体受体及其相关分子机制的基础上，才有可能针对性地开发各种治疗药物和方法，包括疫苗、中和抗体、小分子抑制剂、信号通路阻断药等。比如基于当前研究可以针对TcdB-TFPI作用界面来开发各类中和或阻断分子，从而高效特异地阻止毒素入侵细胞，从而用于预防和治疗C. difficile感染。
作者介绍
陶亮
研究员
陶亮，西湖大学生命科学学院研究员/博士生导师，微生物与宿主互作实验室PI。兼任中国生物物理学会肠道菌群分会理事、浙江省生物信息学学会微生物组学专委会委员、浙江省病原微生物实验室安全研究质控中心专委会委员、The Innovation期刊青年编委。入选“浙江省海外高层次引进计划”创新长期项目、浙江省杰出青年项目、浙江省高校领军人才培养计划等。主持国家自然科学基金青年项目、国家自然科学基金面上项目、浙江省杰出青年科学基金等。以第一或通讯作者在Cell, Nature，Science， Cell Research，Nature Microbiology，Nature Communications，PLoS Pathogens等学术期刊上发表论文十余篇，授权或申请PCT专利7项。
李颜颜
研究员
李颜颜，西湖大学生命科学学院研究员。先后两次被国际内毒素协会授予青年研究员荣誉称号(Yong Investigator Award)。主持有国家自然科学基金青年项目、国家自然科学基金面上项目、浙江省杰出青年科学基金等。发表研究论文四十余篇，其中包括以第一或通讯作者包括发表的Cell, Nature, Cell Research， Nature Communications，PNAS等学术期刊论文，三篇论文被Faculty of 1000点评推荐。
相关论文信息
▌论文标题：
TFPI is a colonic crypt receptor for TcdB from hypervirulent clade 2 C. difficile
▌论文网址：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(22)00181-7
▌DOI：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.02.010
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CellPress细胞出版社
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